原位制备纳米功能化金电极快速检测牛奶中的微生物


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原位制备纳米功能化金电极快速检测牛奶中的微生物

作者：汪学英顾锋尹凡屠一锋时间：2016/11/14 点击：476

　　摘要 [HTSS]在0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS, pH 7.0）中，于2.0 V恒电位电解10 min，即可在金电极表面原位、快速制备纳米功能化修饰膜。经原子力显微镜表征，此修饰膜具有纳米尺度的蓬松结构。此纳米金膜对细胞膜上脂质过氧化反应具有显著的催化作用，因而对细菌产生电流响应。采用传统的标准平板计数法对试样进行细菌培养计数作为校正，以计时电流法电流响应作为输出信号进行细菌的测定，响应电流和细菌数量呈线性关系，据此可对牛奶样品中细菌浓度进行快速测定。本方法的测定范围为1.1×103～2.5×107 cfu/mL，检测时间缩短至1 h以内，较平板计数法有显著改善。

　　[KH*3/4D][HTH]关键词 [HTSS]纳米功能化金电极；微生物；快速检测；脂质过氧化；计时电流法

　　[HT][HK]

　　[FQ（3２，X,DY－Ｗ][CD15] 20110826收稿；20111219接受

　　本文系苏州市科技局项目（No. YJC0910）及常熟理工学院毕业设计（论文）团队课题项目资助

　　* Email: tuyf@suda.edu.cn；wxy62@cslg.edu.cn[HT]

　　1 引言

　　牛奶为人类生活中价值最高的营养物质之一，但易酸败变质\[1\]。我国90％以上的奶牛由农民饲养，规模小、生产水平低、卫生设备不足，因而很多牛奶原料达不到一级标准。在牛奶的生产、运输、销售过程中，还可能受到多种细菌的污染，其中含有很多潜在的有害微生物，这些微生物不仅破坏牛奶质量，而且可能危害饮用者身体健康\[2～4\]。传统的微生物检测技术非常繁琐，需要耗费大量的人力物力，而且检测周期长。按国标GB/T 4789.2进行菌落总数检测需要48 h才能得出结果，难以满足食品安全检测的要求。聚合酶链反应（PCR）\[5\]、酶联免疫吸附实验（ELISA）\[6,7\]等几种快速检测技术通过富集、分离、形态学检测、生物化学测试来鉴别食品中致病菌，缩短了检测时间，但检测费用高、仪器昂贵。电化学阻抗技术亦可应用于细菌的检测，但在分析含菌量较少样品时，检测时间较长，且只有当微生物数目达到106～107个/mL时，这种电阻的变化才能被记录到\[8,9\]。因此，开发快速、简易的适合于牛奶样品中细菌检测的方法具有十分重要的意义。电化学分析方法在这方面具备独特优势\[10～12\]，所需设备简单、操作简便易行、测定速度快、检测成本低，可望开发出实用的检测技术。

　　纳米材料因具有高比表面积、高催化活性等独特性质而备受关注，对许多物质有很高的电催化效应。纳米修饰技术在电化学分析方面亦得到了广泛的应用\[13～15\]。通过表面修饰或功能化获得的化学修饰电极在分析性能上较传统电极取得了长足的进步，从而为开发适合于特定目标的检测技术奠定了良好的基础。

　　纳米功能化电极表现出巨大的潜在应用前景，特定的纳米修饰电极可催化H2O转化成羟基自由基（·OH），·OH具有极高的反应活性，可以使微生物细胞膜发生脂质过氧化\[16\]，在电极上产生氧化电流，且电流的大小与微生物的量成线性关系，通过电流检测实现对微生物的定量检验。文献\[11\]应用此原理成功地进行了水体中大肠杆菌（E. coli）的检测。本研究采用控制电位电解法，以中性的磷酸盐缓冲溶液（PBS）为电解质，一步操作实现对金电极表面的纳米功能化修饰，使其表面形成一层蓬松的纳米级粗糙层，并应用于牛奶中微生物的检测。制备方法简便，线性范围为1.1×103～2.5×107 cfu/mL，检测时间缩短至1 h以内。本方法重复性好、灵敏度高、不需要预处理，有望在牛奶及其它食品的微生物检测中得到应用。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器、材料与试剂

　　CHI660C 电化学工作站（上海辰华仪器公司）；金电极（Φ2 mm）为工作电极，铂电极（Φ2 mm）为对电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极；Dimension Icon原子力显微镜（美国Bruker 公司）；UV3600紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；YX400Z型电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司）；S·SWCJ·2F型超净工作台（上海博泰实验设备有限公司）；303A3S型电热恒温干燥培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）。

　　0.1 mol/L PBS溶液，pH分别为7.0和7.4。LB 培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。大肠杆菌、嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌由常熟理工学院生物与食品工程学院发酵工程技术研究中心提供。牛奶样品由常熟市圣力乳业有限公司提供。实验用水均为二次蒸馏水。

　　2.2 纳米功能化金电极的制备及表征

　　金电极用0.3 和0.05

　　䥺SymbolmA@ m的A12O3粉抛光，依次在HNO3（1∶1, V/V）、无水乙醇及二次蒸馏水中超声清洗5 min，红外灯下烘干。上述电极置于0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.0）中，于2.0 V恒电位电解600 s; 在0～1.5 V范围内循环伏安扫描至电流稳定；用水反复冲洗，并储存在水中备用。采用原子力显微镜表征纳米功能化修饰膜的表面形貌。采用亚甲基蓝检验法验证纳米功能化金电极的性能：用PBS溶液将8 mL 0.15 mmol/L亚甲基蓝溶液释至100 mL，分别以裸金电极和纳米功能化金电极为工作电极，在1.0 V恒电位电解30 min，分别测定原溶液和电解后溶液的吸收光谱曲线。

　　 分析化学第40卷

　　第5期汪学英等：原位制备纳米功能化金电极快速检测牛奶中的微生物 

　　2.3 细菌总数的测定方法

　　大肠杆菌（E. coli）是生物肠道内和环境中最普遍存在，且最大量的细菌，通常作为细菌研究的模式生物。牛奶中的细菌总数在很大程度上决定于环境卫生、挤奶机、牛奶贮存和运输设备的清洁程度和牛奶的冷藏温度等因素，因此大肠杆菌是最可能存在的细菌。健康奶牛的乳房内也总存在一些细菌，但仅限于少数几种细菌，如小球菌、链球菌等，细菌数量约为102个/mL；如奶牛发生乳房炎，则在奶中会检出大量的金黄色葡萄球菌、链球菌和化脓杆菌等致病菌。因此，本研究主要以大肠杆菌作为研究对象，并分别考察大肠杆菌、嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌的响应，以进行比较，评估本方法对检测不同种类细菌的适用性。

　　2.3.1 平板计数法参照GB 4789.22010 《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行。

　　2.3.2 计时电流法于37 ℃恒温水浴中，用无菌移液管准确移取10 mL经高压灭菌的0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）于电解池内，以纳米功能化金电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，恒电位1.0 V进行计时电流测定，记录加入一定量样品后产生的电流响应值。

　　2.3.3 校正曲线与定量测定对同一样品用标准平板计数法和计时电流法同时进行测定，得到电流响应和牛奶中细菌数量的对应关系，建立校正曲线。根据仪器测定的相应样品的电流响应，计算每毫升样品细菌数量。

　　2.4 电极的活化再生

　　由于电极表面是纳米尺度粗糙结构，具有较强的吸附性，测定中细菌氧化产物会吸附在电极上，所以测定中电流响应会逐步减小。因此，每次测定后需对电极进行活化再生处理。处理方法是用PBS液冲洗后，再在其中于2.0 V电解产生氧气，利用氧气带走细菌被氧化的中间产物，从而使电极重新活化。3 结果与讨论3.1 纳米功能化金电极的性能和作用机理

　　采用AFM技术对纳米功能化金电极表面形貌进行表征。从图1可见，经阳极氧化活化处理后，电极表面形成了蓬松的结构。这是由于金电极表面吸附的·OH或O与Au原子发生交换，进入电极表层所致，电极表面的吸附的·OH或O和Au原子具有较强的活性\[17\]。

　　[TS（][HT5”SS] 图1 金电极纳米功能化表面的原子力显微镜图（A）三维形貌，（B）2

　　䥺SymbolmA@ m尺度，（C）500 nm尺度

　　Fig.1 Surface morphology of nanofunctionalized gold electrode （A） 3D AFM image, （B） at scale of 2

　　䥺SymbolmA@ m and （C） at scale of 500 nm[HT][TS）]

　　图2A为所制备纳米功能化金电极在0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中的循环伏安图。在修饰电极上，除了在电位约为1.5 V处因产生氧气而使电流增大外，还出现一对很强的氧化还原峰（a），而普通金电极几乎不出峰（b）。据文献报道，电流的增加主要是因为在纳米功能层的催化下生成了·OH，且·OH被吸附于电极表面，占据着电极表面的活性位点\[17,18\]，其反应如下：

　　Au*＋H2O→Au*OH（1

　　䥺Symbolm@@ n）

　　䥺Symbolm@@ ads＋H＋＋e

　　Au*＋OH－→Au*OH（1

　　䥺Symbolm@@ m）

　　䥺Symbolm@@ ads＋e

　　[TS（][HT5”SS]图2 （A）纳米功能化金电极（a）及裸金电极（b）在0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中的循环伏安曲线（扫速：100 mV/s），（B） 1.2×10

　　䥺Symbolm@@ 5 mol/L亚甲基蓝溶液（a）及经裸金电极（b）或纳米功能化金电极（c）电解30 min后的吸收光谱

　　Fig.2 （A） Cyclic voltammograms of （a） nanofunctionalized gold electrode and （b） bare Au electrode in phosphate buffer （pH 7.0, scan rate:100 mV/s）；（B） Absorption spectra of 1.2×10

　　䥺Symbolm@@ 5 mol/L methylene blue （MB ）（a） and electrolyzed for 30 min with bare Au electrode （b） or nanofunctionalized gold electrode （c） as working electrode[HT][TS）]

　　图2B采用亚甲基蓝检验法进行了验证。呈蓝色的亚甲蓝溶液遇到强氧化剂时失电子形成无色的3,7双二甲氨基吩噻嗪离子，通过亚甲蓝溶液吸光度的变化可确定·OH的含量\[19\]。以裸金电极电解30 min后亚甲基蓝溶液，吸光度（b）较原溶液（a）下降并不明显；以纳米功能化金电极电解后，亚甲基蓝溶液吸光度值较电解前明显减小（c），说明在此条件下，修饰电极上产生了·OH，使亚甲基蓝失电子形成无色的3,7双二甲氨基吩噻嗪离子。

　　细菌细胞膜主要由脂类和蛋白质组成的双层膜结构，其脂质分子相当稳定，但当有活泼自由基存在时，就可以导致脂质过氧化\[16\]，从而在电极上产生电流。当将修饰电极置于含菌的PBS溶液中，电极表面活性位点的羟基自由基将会引起细菌细胞膜的脂质过氧化，细菌数量越多，产生的氧化电流越大。因此，可以根据氧化电流的变化与细菌数量变化的关系对牛奶中细菌总数进行快速检测。

　　3.2 测定条件的优化

　　考察了计时电流检测工作电位及pH值对测定结果的影响。结果（图3）表明，随着电压的增大，响应电流随之变大。但当电位超过1.0 V时，电流不稳定，故选择测定电位为1.0 V。在所研[TS（][HT5”SS]图3 （A）检测电位及（B）pH值对测定响应的影响

　　Fig.3 Effect of （A） applied potential and （B） pH value of buffer solution on detection response

　　䥺SymbolpB@ C，在0.1 mol/L PBS溶液，含菌量约1.1×106 cfu/mL。

　　Temperature: 25

　　䥺SymbolpB@ C, substrate solution: 0.1 mol/L phosphate buffer containing 1.1×106 cfu/mL of bacteria.[HT][TS）]究范围内，随pH值增大，氧化电流变化值增加，至pH=8时达到一个平台。但此时稳定性变差，故最佳pH值选取为7.4。

　　3.3 电极对细菌的响应特性

　　在选定的最佳工作条件下，向10 mL 0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中依次加入10

　　䥺SymbolmA@ L含1.1×106 cfu/mL细菌悬浊液，修饰电极上的计时电流曲线见图4，表明修饰电极催化细菌脂质过氧化速度很快，可用于细菌的快速检测。

　　培养基中的共存组分的干扰情况如图5所示： NaCl、琼脂对测定无影响；10 mL PBS溶液中加入100

　　䥺SymbolmA@ L的蛋白胨、牛肉膏、牛奶时，电流响应略有波动，但并不产生明显的电流响应，故亦不影响测定。分别考察了加入含550和1100 cfu/mL混合菌的牛奶，及分别加入同浓度的大肠杆菌、嗜热链球菌和金黄色葡萄球菌的牛奶悬液后的电流响应，从图5可见，等量不同种类的细菌产生的响应值基本相同，表明本方法对各种不同的细菌产生基本相同的响应，而牛奶等基质不产生响应，因而可作为牛奶中细菌总浓度的测定方法。

　　[TS（][HT5”SS] 图4 修饰电极对细菌响应的计时电流曲线，插图A为电极响应对细菌总数的校正曲线

　　Fig.4 Chronoamperometric curve of response upon the adition of bacteria. Inset is calibration curve of current response versus concentration of bacteria[HT][TS）]

　　[TS（][HT5”SS] 图5 培养基成分及等浓度不同细菌的电流响应

　　Fig.5 Current response of culture medium constitution and different bacteria

　　a, b为550、1100 cfu/mL的混合菌；c, d, e 分别为1100 cfu/mL的大肠杆菌，嗜热链球菌，金黄色葡萄球菌。

　　a, b mixed bacteria at concentrations of 550, 1100 cfu/mL respectively; c, d, e Escherichia coli, Streptococcus thermophilus and Staphylococcus aureus respectively, at concentration of 1100 cfu/mL[HT][TS）]

　　3.4 电极分析性能及对实际样品中细菌总数的测定

　　以计时电流法进行牛奶样品中细菌总数的测定，同时用平板计数法进行对照，建立校正曲线（图4A），其回归方程为：Δi （nA）＝1.43 logC

　　䥺Symbolm@@ 4.58 （C为样品中细菌的浓度，单位：cfu/mL），电流响应与细菌浓度在1.1×103～2.5×107 cfu/mL范围内呈良好的线性

　　[ＦＱ（9*2。19*2，Ｙ－ＷＺ][HT5”SS][*4]表1 本方法与平板计数法检测大肠杆菌样品结果比较

　　Table 1 Comparison of analytical results obtainedfrom present method and GB （national standard） method

　　[HT6SS][BG（][BHDFG3,WK５，ＷＫ7。２，ＷＫ６Ｗ]样品

　　Sample本方法　Present method国家标准方法　GB Method相对误差　RE（%）152060482008.0

　　25576859500

　　䥺Symbolm@@ 6.3361180570007.341536001470004.551367501300005.2[BG）F][HT][]

　　关系，r＝0.9959。制备5份牛奶样品，用本方法进行测定，对每个样品平行测定5次，并与GB4789平板菌落计数法相对照，结果见表1。从表1可见，用2种方法测定5个样品，其最大相对误差为8.0%；同时采用t检验法判断 2种方法所得结果之间并无显著性差异（t＝1.375＜t0.05＝2.776）；电极经活化再生处理后重复使用所得相对标准偏差（RSD）为2.9%。

　　结果表明，本研究制备的纳米功能化修饰金电极的方法简便，性能稳定，电极可更新，使用寿命长。本修饰电极用于牛奶中细菌总数的测定是可行的。将此电极用于牛奶中细菌的测定相比于传统生物学方法更简单、快速和准确，大大缩短了分析时间，且检出限低，具有一定的推广应用价值。

　　

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　　Rapid Detection of Microorganisms in Milk Using an Insitu

　　Prepared Nanofunctionalized Gold Electrode

　　

　　WANG XueYing*1， GU Feng1, YIN Fan1, TU YiFeng*2

　　

　　1（Department of Chemistry, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China）

　　2（Institute of Analytical Chemistry, Soochow University, Suzhou 215123, China）

　　

　　Abstract An insitu, facile and rapid method was developed to prepare a nanofunctionalized gold electrode。 By the electrolysis under applied potential of ＋2 V in PBS of pH 7.0 for 10 min, a rough nanoporous film formed on the surface of a polished gold plate electrode。 This novel nanofunctionalized gold electrode could be applied for rapid detection of bacteria quantity in milk. The detection was based on the catalysis of lipid peroxidation on cell membrane of bacteria by the nanoporous Au film. The response of the current in chronoamperometry would linearly respond the bacterial content in milk which was calibrated by the national standard method （Standard plate count method）。 Therefore the accurate quantity of bacteria was attained from the current response on prepared electrode. The results showed that the target bacteria could be detected at a content range from 1.1×103 cfu/mL to 2.5×107 cfu/mL. The whole process of the detection could be completed within 1 h.

　　Keywords Nanofunctionalized gold electrode; Bacteria; Rapid detection; Lipid peroxidation; Chronoamperometry

　　（Received 26 August 2011; accepted 19 December 2011）